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【选购宝典】如何选择无细胞蛋白表达系统

                            来源:佚名    2012-7-31

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摘要:

与基于细胞的蛋白表达系统相比较,无细胞蛋白表达系统具有独特的优势,包括节约时间、提高具有功能的、可溶的、全长蛋白的总体产量。至于如何选择无细胞蛋白表达系统,让Promega的专家一一道来。

在此,我们介绍了根据模板类型、期望产率以及下游实验等因素来选择无细胞蛋白表达系统的标准。

介绍

与基于细胞的蛋白表达系统相比较,无细胞蛋白表达系统具有独特的优势,包括节约时间(图1)、提高具有功能的、可溶的、全长蛋白的总体产量。此外,无细胞蛋白表达系统更适用于激酶等毒性蛋白的表达、也可使用经过修饰的tRNA来进行标记,在某特定位点掺入非天然的氨基酸。同时,这些系统还可以用于高通量实验(1)。我们提供完备的无细胞蛋白表达系统,为研究者提供了多种选择,可用于进行蛋白的特征描述,包括免疫沉淀、Pull-down实验和酶学检测。

图1. 与细胞内蛋白表达相比,无细胞蛋白表达系统能够显著地节约时间。

选择一个无细胞蛋白表达系统,最主要的几点考虑因素包括细胞提取物或裂解物的来源、模板以及期望的蛋白产量。本文介绍的信息可帮助研究者选择适合其实验体系和下游应用的无细胞蛋白表达系统。

考虑因素 — 模板

在使用插入片断或载体进行真核细胞系统蛋白表达时,有以下几个因素需要考虑:(i)ATG起始密码子应该是位于转录起始位点下游的第一个ATG密码子;(ii)理想化而言,在启动子之后,ATG应该包含在Kozak共有序列之内;(iii)在模板序列的3'端应包含终止密码子;(iv)终止密码子之后应带有合成的多聚A尾(2)。此外,使用TNT® T7麦胚偶联系统(TNT® T7 Coupled Wheat Germ System)时,载体还应包含一个T7终止子序列或该载体呈线性化。

在原核系统中,起始密码子的选择几乎无一例外地依赖于核糖体结合位点(ribosomal binding site, RBS)的存在,这个位点包含了阅读框架的起始信号(2)。经过优化的核糖体结合位点能够大大提高原核细胞内蛋白的表达。原核系统不识别位于ATG起始密码子上游的任何ATG,除非这些ATG含有一个处于合适位置的核糖体结合位点。

使用兔网织红细胞裂解物(Rabbit Reticulocyte Lysate, RRL)时,DNA介导的蛋白合成与mRNA为起始的蛋白合成相比较,具有以下优点:当进行高水平的蛋白合成时,不需要处理mRNA的繁杂操作过程。

基于真核细胞RNA的翻译

在1950至1960年间,研究人员证实了兔网织红细胞裂解物可以经过人为操作,用于外源mRNA介导的蛋白合成,这样可以只把感兴趣的蛋白合成出来(1)。经过核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物和Flexi®兔网织红细胞裂解物均增加了一些添加剂,为mRNA的翻译过程进行了优化。这些添加剂包括氯高铁血红素—用于防止亚铁血红素调节的elF-2α激酶(HRI)的激活作用;能量生成系统,含有经过测试的磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸;以及小牛肝脏tRNA—用于平衡消耗的tRNA种类,这样可以优化密码子的使用,并扩大可被高效率翻译的mRNA的范围。与经过核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物相比较,Flexi®兔网织红细胞裂解物系统可提供更强的灵活性,能够将翻译反应的很多参数进行优化,这些参数包括Mg2+浓度、K+浓度,以及DTT的存在与否。

麦胚提取物(Wheat Germ Extract, WGE)含有合成蛋白所需要的细胞组分(tRNA、核糖体、起始因子、延长因子以及终止因子)。该提取物系统做了进一步优化:添加了由磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶组成的能量生成系统;添加了亚精胺,用于加强蛋白链延长的效率,以防止蛋白链的终止过早地发生;添加了醋酸镁,并使其浓度适合大多数种系mRNA的翻译。最后,还单独提供了醋酸钾,以用于优化更多种类的mRNA。

麦胚提取物适用于表达小分子的蛋白,或用于表达富含于兔网织红细胞裂解物中的蛋白。当RNA制备物中含有少量的dsRNA或硫醇时,该系统也很适用,上述这些物质具有抑制翻译的作用。在表达植物蛋白、酵母蛋白或其它真菌蛋白时,研究人员也会发现麦胚提取物比兔网织红细胞裂解物更合适。

基于真核细胞DNA的转录和翻译

二十世纪九十年代,偶联的转录/翻译(即TNT®)系统被开发出来,该系统包含兔网织红细胞裂解物或麦胚提取物,并带有T7、T3或SP6 RNA聚合酶,这些系统使基于DNA的蛋白合成成为现实。

TNT®兔网织红细胞裂解物转录/翻译偶联系统(TNT® Coupled Reticulocyte Lysate Transcription/Translation Systems)和TNT®快速转录/翻译偶联系统(TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systems)仅需一个试管,即能够以质粒为模板转录和翻译蛋白(图2)。常规的TNT®偶联系统中的不同组分以单独包装提供,包括三种氨基酸混合物:甲硫氨酸缺失的混合物、半胱氨酸缺失的混合物或亮氨酸缺失的混合物。TNT®快速偶联系统提供一个混合母液,包含所有的反应组分(包括甲硫氨酸缺失的氨基酸混合物),减少了加样步骤,节约了时间。TNT® T7 PCR DNA快速系统(TNT® Quick for PCR DNA)是为PCR反应产生的线性DNA模板而特别设计,这样的模板比质粒DNA模板往往要求更高的钾离子和镁离子浓度。

图2. TNT® 兔网织红细胞裂解物转录/翻译偶联系统以质粒为模板,在一个试管内完成转录和翻译;TNT® PCR DNA 快速系统对于PCR模板效果良好。

对于真核细胞转录/翻译偶联反应,除兔网织红细胞裂解物之外,TNT®麦胚提取物系统(TNT® Coupled Wheat Germ Extract Systems)是又一个选择,后者也是单个试管的反应模式。普通的麦胚提取物通常是利用SP6, T3或T7 RNA聚合酶启动子在体外合成RNA,然后再进行翻译反应。与此不同的是,TNT®麦胚提取物系统将转录反应直接整合到翻译反应混合物中。

基于原核细胞DNA的转录和翻译

E. coli S30提取物系统(E. coli S30 Extract Systems)是从E. coli B菌株制备而来,该菌株中omp T 胞内蛋白酶和lon蛋白酶活性缺失。这种缺失能够大大提高被表达蛋白的稳定性,否则,在细胞内表达的蛋白会被蛋白酶所降解。E. coli S30提取物系统能够表达更多量的蛋白,这些蛋白在细胞内表达时,由于宿主编码的抑制剂的激活,这些蛋白的表达量很低。E. coli S30提取物的DNA模板可以是线性的,也可以是环状的。线性DNA为模板的S30提取物(E. coli S30 Extract System for Linear Templates,Cat.# L1030)是从E.coli B菌株中制备的,该菌株核酸外切酶V(recBCD enzyme)缺失。以线性DNA为模板的S30提取物比以环状DNA为模板的S30提取物(E.coli S30 Extract System for Circular DNA, Cat.# L1020)和T7 S30提取物(E. coli T7 S30 Extract System for Circular DNA, Cat.# L1130)的活性低。在使用这些系统时,研究人员仅需准备带有适当的原核细胞启动子和核糖体结合位点的克隆DNA即可。

以环状DNA为模板的E. coli T7 S30提取物系统(Cat.# L1130)简化了克隆在质粒或Lambda载体上的DNA序列的转录/翻译反应,该提取物中包含用于转录的T7 RNA聚合酶,以及翻译反应所需的所有必备组分。研究人员仅需提供带有T7启动子和核糖体结合位点的克隆DNA。生物通 www.ebiotrade.com

考虑因素 — 蛋白产量

对于大多数体外表达系统而言,每50μl反应体系可产生皮摩尔级或纳克级的蛋白量。通常,该产量足够用于大多数的蛋白放射性分析、荧光分析以及抗体分析,例如聚丙烯酰胺凝胶分离、Western blotting、免疫沉淀;或者,也可进行酶学或生物活性的检测,这取决于目的蛋白的特性。如果是放射性检测,应在翻译反应体系中加入同位素标记的氨基酸,翻译反应结束后,可使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合放射性自显影来检测目的蛋白。或者,也可使用非放射性标记方法,如荧光法、化学发光法或比色法〔如,Promega的FluoroTectTM系统(Cat.# L5001)和TranscendTM系统(Cat.# L5070, L5080)〕。

也可以使用免疫杂交或免疫沉淀的方法来进行检测。通常,从体外翻译反应得到的蛋白,其功能活性可在翻译反应混合物中直接进行检测。如果有必要纯化蛋白,可将目的蛋白与纯化标签融合,使目的蛋白便于从体外翻译反应体系中纯化出来,然后可进行进一步研究。

高产率的无细胞蛋白合成

如前所述,大多数无细胞表达系统所产生的蛋白量是有限的。用于表达真核细胞蛋白的麦胚提取物经过进一步修饰,能够提高蛋白表达量,可用于多种功能和结构蛋白质组学研究。SP6 TNT®高产率系统(TNT® SP6 High-Yield Wheat Germ Protein Expression System, Cat.# L3260, L3261)使用高产率提取物,补充了SP6 RNA聚合酶以及其它组分。分批模式下,该系统可合成的蛋白量是100 μg/ml,使用透析模式时,可得到200–400 μg/ml的蛋白(图3)。此外,可不经过蛋白纯化,即可在反应体系内直接进行酶活性的检测(图4,参考文献3)。通过亲和标签,可完成简便的纯化,仅需一步即告完成。也可经过微小的修改,在该体系内实现对目的蛋白的标记。

图3. Coomassie® 染色的SDS PAGE。使用TNT® SP6 高产率提取物系统以透析模式表达蛋白,反应体系位为100μl,质粒模板8μg,提取物60μl。

反应体系置于透析杯(MWCO 12,000 BioTec International, 经销-Daiichi Pure Chemicals DBC Code 212956)内,Uniplate(Whatman®)中含有2.5ml透析缓冲液,于25℃孵育18小时。透析缓冲液含有12 mM HEPES、0.5 mM 亚精胺、5 mM DTT、80 μM 氨基酸、 70 mM KOAc、1.7 mM ATP、0.6 mM GTP、0.6 mM CTP、6 mM UTP、20 mM CP和3.5 mM Mg(OAc)2。泳道1:萤火虫萤光素酶,MW 62 KDa;泳道2:Monster Green® GFP,MW 28 KDa;泳道3:人源化的海肾萤光素酶,MW 36 KDa。

图4. 使用FluoroTectTM GreenLys标记系统检测分批模式下处理的procaspase-3蛋白。带或不带N端HQ标签的Procaspase-3(pF3K WG(BYDV) Flexi®载体)经分批模式于体外合成,采用FluoroTectTM GreenLys系统进行标记。使用含有100 U (1 μl) 的caspase-8 或 caspase-3 (BioMol)的裂解物10μl 将Procaspase-3激活,37℃孵育1小时(图A)。使用1 μl的10 mM HEPES (pH 7.5)处理细胞,取上清(S)做为假处理组,37℃孵育1小时。每个泳道相当于1μl最初反应体系所产生的蛋白量。图A,通过荧光标记或Western分析,procaspase-3的激活模式如图所示。泳道S,未经caspase-8处理过的上清;泳道A,经过caspase-8处理过的上清;"FluoroTectTM labeling"图中的泳道M,荧光分子量Marker(Sigma);"Western Analysis"图中的泳道M,ProSieve®彩色蛋白Marker(Cambrex)。图B,显示位于D9,D28(用于去除结构域前体)和D175(用于初始激活)的假设的蛋白切割条带。横条中的数字为蛋白片断的分子量估计值(kDa);p17为位于D28和D175之间的蛋白片断;p12为蛋白的C末端片断。图C,凝胶图片显示,37℃孵育1小时,procaspase-3 被caspase- 8充分消化(泳道 8A),而procaspase-3 未被 caspase-3 充分消化(泳道3A)。图D,如果将图C中的反应体系在4℃再孵育24小时,可观察到procaspase-3能够被其自身成熟形态的酶(泳道3A)进行有限的自消化。图C和图D中的泳道M,荧光分子量Marker (Sigma)。 

表1. Promega无细胞表达系统比较表:模板、应用及产率

总结

无细胞表达系统能够帮助你完成蛋白的快速表达,产量足够用于下游实验。与细胞内表达相比,这些系统对毒蛋白的敏感度低;结合应用某些附加组分,如微粒体膜,可表达正确折叠的蛋白以及经过修饰的膜蛋白;同时,这些系统还可以在目的蛋白上掺入标记物或用于纯化的标签。Promega公司的无细胞蛋白表达平台为您提供进行蛋白研究所需要的多种产品选择。

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参考文献

1. Arduengo, M., Schenborn, E. and Hurst, R. (2007) The Role of Cell-Free Rabbit Reticulocyte
Expression Systems in Functional Proteomics. In: Cell-Free Expression Kudlicki, W., Katzen, F.
and Bennett, R., eds. Landis Bioscience, Austin, TX.
2. Brouette, C., Betz, N. and Kobs, G. (2002) Promega Notes 80, 10–3.
3. Zhao, K. et al . (2006) Promega Notes 94, 31–5

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